Etapes préfermentaires
En vinification conventionnelle, le recours au sulfitage permet de réguler et limiter l’ensemble des micro-organismes du vin qui disposent, dès les premiers stades de la vie du vin, des conditions nécessaires à leur développement : milieu liquide sucré, température favorable. Naturellement, la levure Saccharomyces cerevisiae va finir par s’imposer, du fait de son taux de croissance important, de sa consommation rapide de sucre et de sa production d’alcool. Saccharomyces possède une forte résistance à l’alcool alors que les autres espèces de levures ont une résistance moindre.
Le levurage est une façon de réguler naturellement le milieu. Les levures, ainsi apportées massivement, vont saturer le moût rapidement et limiter la croissance des autres micro-organismes. Encore faut-il que ce levurage soit réalisé dans de bonnes conditions. Le risque d’échec peut être important si la préparation du levain n’est pas optimale. La température et le temps de réhydratation des LSA (Levures Sèches Actives) doivent être conformes aux préconisations du fabricant. Dans le cas contraire, cela se traduit par une mortalité, parfois importante des levures. Or, en période de vendanges, il est fréquent d’oublier un levain en cours de réhydratation, de ne pas avoir le temps de contrôler la température de réhydratation, ou de transférer son levain en cuve quelques heures trop tôt ou trop tard, etc.
Quid des vinifications sans soufre ?
Mais une tendance croissante est le recours à des vinifications sans SO2 et sans levurage. Dans ce cas, il convient d’être vigilant sur la qualité microbiologique du moût. L’absence de SO2 va empêcher ce tri des micro-organismes décrit précédemment. Car même si la diversité de micro-organismes présents peut constituer un apport bénéfique au niveau aromatique, elle comporte également son lot de risques. A ce stade, des levures d’altération, comme Brettanomyces, ou des bactéries lactiques peuvent proliférer et concurrencer Saccharomyces cerevisiae. Le bon déroulement de la fermentation alcoolique va dépendre alors de l’équilibre microbiologique qui s’est instauré dès cette phase préfermentaire.
L’emploi d’un levain est une réponse intéressante en terme de maitrise de la microbiologie du moût. Ce levain, fabriqué avec les raisins du domaine quelques jours avant les vendanges et contrôlé, permettra d’assurer un démarrage rapide des fermentations. Le contrôle du levain consiste à vérifier le bon équilibre microbiologique. Une méthode d’analyse telle que l’épifluorescence permettra de vérifier que les levures possèdent une bonne viabilité et constituent la population majoritaire. Il arrive dans certains cas que les populations de bactéries soient supérieures à celles de levures. Grâce à la détection précoce permise par l’épifluorescence, un tel levain sera écarté pour éviter une fermentation malolactique sous marc. L’absence de levures du genre Brettanomyces peut également être contrôlée par PCR quantitative. Le LACO est en mesure de déterminer les populations de levures du genre Brettanomyces à toutes les étapes, y compris sur moût en pleine fermentation alcoolique. Ces vérifications, qui ne prennent que quelques heures, sont une garantie de ne pas aborder les fermentations avec un gros risque de déviation microbiologique.
Arrêt de Fermentation
En cas de ralentissement voire d’arrêt de fermentation, il convient d’être réactif. Une analyse microbiologique peut se révéler précieuse à ce stade. Il faut recourir à des analyses rapides. Par la technique d’épifluorescence, le LACO détermine, en quelques heures, les populations de levures et de bactéries. Si la population bactérienne est importante, une mise au propre sera nécessaire avant tout ensemencement avec une levure de reprise de fermentation ou un pied de cuve.
Cette étape doit être réalisée avec précaution, en respectant le protocole fourni par votre œnologue. Dans ce cas, comme pour les étapes précédentes, le respect des conditions de température est primordial pour garantir la revivification et l’implantation du levain. Cette température est idéalement de 30°C pour la réhydratation de levures et dans tous les cas (pied de cure ou levures du commerce), il faut éviter tout choc thermique. Un écart de température de 5°C peut être létal dans le cas de micro-organismes comme les levures.
Les différentes techniques de suivi microbiologique du LACO
Epifluorescence
Cette méthode est relativement simple, mais requiert l’expérience du microbiologiste pour une numération précise. Elle consiste à réaliser un marquage des micro-organismes viables puis de les compter par observation au microscope. Pour ce marquage, une molécule fluorescente est utilisée, ayant la particularité de pénétrer les cellules par transport actif. Cela signifie que seules les cellules vivantes peuvent être marquées, les mortes ne pouvant pas incorporer la molécule fluorescente.
Cette réaction est rapide et prend environ 30 minutes. Les micro-organismes sont ensuite révélés grâce à un microscope à épifluorescence (…). Il suffit alors de les compter. Le microscope ayant été étalonné, le comptage est ramené à l’unité de volume pour fournir une numération par mL.
qPCR
La qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) est une technique basée sur la quantification de l’ADN d’un micro-organisme cible au sein d’un échantillon.
Tous les micro-organismes de l’échantillon sont récupérés par centrifugation. Les cellules vont ensuite être lysées pour libérer leur ADN. Cet ADN sera ensuite purifié pour la réaction d’amplification.
La réaction d’amplification consiste à faire réagir cet ADN avec une amorce, c’est-à-dire une séquence d’ADN spécifique du micro-organisme cible, au moyen d’une enzyme, l’ADN polymérase et de nucléotides, molécules constituantes de l’ADN. Couplé à cette amorce, une molécule fluorescente nommée fluorochrome, dégagera un signal lumineux quantifié en temps réel par l’appareil dans lequel se déroule toute la réaction.
En résumé, plus la quantité d’ADN est importante et plus le signal lumineux est important et rapidement détecté.
Cette technique est d’une grande précision car basée sur l’ADN, spécifique du micro-organisme cible. Cela permet de quantifier les différentes espèces de micro-organismes présents dans un échantillon.
Tout type de micro-organisme peut être quantifié par cette méthode, sous réserve de disposer de la séquence cible. Il est ainsi possible de quantifier toute la microflore du vin : les levures des genres Saccharomyces ou Brettanomyces, les bactéries lactiques des genres Lactobacillus, Pediococcus et Oenococcus, les bactéries acétiques des genres Acetobacter ou Gluconobacter.
Il convient pour chaque analyse de respecter les préconisations de prélèvement pour garantir un résultat représentatif de la contamination.
Le point sur Brettanomyces
Brettanomyces, comme l’ensemble des micro-organismes du vin, est présent dès la vigne, en quantités variables selon les parcelles et le millésime. Il représente un vrai risque dès les étapes de fermentation, particulièrement en condition de surmaturité, de macération pré-fermentaire, de température élevée, de SO2 faible à nul. Le cumul de ces paramètres doit inciter à être vigilant car ce micro-organisme produit des phénols volatils, molécules odorantes communiquant au vin des odeurs animales. Le vin perd alors sa dominante fruitée au profit de ces notes désagréables. Le stade entre les fermentations alcoolique et malolactique est très sensible car le vin, non protégé par le SO2, est exposé à Brettanomyces.
Envisager des contrôles de population réguliers, particulièrement si la FML tarde à démarrer, peut s’avérer judicieux. Ensuite, en élevage, les meilleurs facteurs de protection sont une température faible et un SO2 élevé. Le revêtement des cuves peut également avoir une grande in fluence sur le maintien d’une contamination Brettanomyces dans une cave. Ainsi des cuves cloquées sont un facteur de risque supplémentaire. De la même façon les contenants bois peuvent être vecteurs de contamination : on sait que les micro-organismes peuvent pénétrer jusqu’à presque un centimètre de profondeur dans les douelles.
Le meilleur atout vis-à-vis de Brettanomyces reste donc la prévention.
Brettanomyces ne peut être détecté avec précision par épifluorescence, le marquage étant non spécifique. La seule chose qui le différencierait des autres levures serait sa forme. Or celle-ci est parfois très similaire à celle de Saccharomyces cerevisiae, levure de fermentation.
La technique de choix pour le repérer et le quantifier est dans ce cas la qPCR. C’est la technique la plus « mature » à l’heure actuelle et celle retenue par le LACO. Les autres techniques sur le marché (épifluorescence, cytométrie en flux) sont soit non spécifiques (il est alors considéré que toutes les levures dénombrées sont des Brettanomyces, simplement parce que le prélèvement est réalisé durant l’élevage) soit imprécises (réalisation d’un marquage mais non optimal car pouvant réagir avec d’autres espèces).
La qPCR permettra une numération rapide et précise de Brettanomyces et de statuer sur la contamination. Il est régulièrement pointé du doigt le fait que la qPCR détecte également les cellules mortes. C’est effectivement le cas puisque la détection se base sur l’ADN. Or les cellules mortes contiennent encore leur ADN et la durée avant la lyse cellulaire est encore mal connue. Selon les études réalisées, elle peut varier de quelques semaines à quelques mois.
Fort de ces observations, LACO a décidé d’améliorer sa technique d’analyse par qPCR et travaille à développer une méthode permettant justement d’éliminer les cellules mortes pour apporter une quantification plus proche du risque réel que représente Brettanomyces. Les résultats de ces essais devraient être publiés courant 2018.
L’offre globale du LACO
A chaque situation, il existe une analyse microbiologique adaptée.
